In früheren Zeiten, war es in Österreich nicht erlaubt, den evangelischen Glauben auszuüben. In Wien jedoch war es bereits zu Zeiten Karls VI. und Maria Theresias in geringem Ausmasse gestattet, weil sich in der Stadt öfters Botschafter protestantischer Mächte aufhielten. Am 13. Oktober 1781 erliess Joseph II. ein Toleranzedikt, welches den augsburgischen und helvetischen Religionsverwandten (Protestanten) und den griechisch-orthodoxen Glaubensangehörigen eine Ausübung ihrer Religion in privatem Rahmen erlaubte. Die Protestanten durften eine Schule und ein Bethaus errichten. Am 2. März 1782 erlaubte Joseph II. die Gründung der protestantischen Wiener Gemeinde. Unter ihm wurde das ehemalige Königinnenkloster, auch Clarissenkloster genannt, an der Dorotheergasse aufgelassen. Teile der Gebäulichkeiten wurden von der reformierten Kirchengemeinde gekauft, mitunter die Klosterkirche. Diese erhielt später einen direkten Zugang von der Strasse her.
Trotz des Toleranzediktes durfte die Kirche zunächst von aussen als solche nicht erkennbar sein und keinen direkten Eingang von der Strasse her haben. Im Inneren wurde die Kirche im Laufe der Zeit mehrmals verändert. Die klassizistische Ausstattung wie sie heute vorhanden ist entstand in den Jahren 1783 und 84 nach Plänen des Hofarchitekten Gottlieb Nigelli. Auffallend sind die zwei grossen Deckenkuppeln und die seitlich über Säulen verlaufenden Emporen.

Der Raum weist ausschliesslich plastischen und ornamentischen Schmuck auf, Bilder oder figurale Elemente gibt es nicht. Das Henriettentor, ein Seiteneingang, welcher eigens für die reformierte Gattin Erzherzog Karls, Henriette von Nassau-Weilburg, eingebaut wurde, existiert heute nicht mehr. Um 1887 wurde die Dorotheerkirche aussen komplett neu gestaltet: Sie erhielt eine neubarocke Fassade mit einem Kirchturm über dem neuen strassenseitigen Portal, und das Innere wurde neu angeordnet. Nach mehreren Renovationen im 20. Jrh. erstrahlt die Kirche heute in neuem Glanz.
Früher befand sich in der Dorotheerkirche das prächtige Grabmahl von Feldhauptmann Niklas Graf von Salm, welcher die Stadt Wien bei der ersten Türkenbelagerung erfolgreich verteidigt hatte. Später wurden seine Gebeine in die Votivkirche verlegt.