In einem Badenort nahe einer grossen Stadt im letzten Drittel des 19. Jahrhunderts. Die Szene spielt im Zimmer Eisensteins, in das vom Garten her ein Liebeslied hereinklingt. Rosalinde erkennt die Stimme, die das Lied singt: Es ist ihr ehemaliger Gesangslehrer und Verehrer Alfred. Ihre Kammerzofe Adele bittet sie um Erlaubnis, auszugehen um eine Tante besuchen zu können, die krank im Bett liegt. Aber in Wahrheit will Adele heimlich zu einem Fest des Prinzen Orlofsky, für das sie von ihrer Schwester Ida per Brief eingeladen wurde. Da Rosalinde nicht allein bleiben will, weil ihr Ehemann in Arrest gehen muss wegen Beleidigung einer Amtsperson, kommt sie Adeles Wunsch nicht nach. Zudem bangt sie um ihre Tugend wegen Alfreds Nähe. Sogleich erschein dieser und bittet um Rosalindes Zusage, ihn zu empfangen, sobald ihr Ehemann ins Gefängnis gegangen ist. Einige Minuten darauf kommt Eisenstein nach Hause in Begleitung seines Advokaten Blind. Er schimpft mit ihm, da durch sein Ungeschick die Strafe noch härter ausgefallen ist. Rosalinde gelingt es nicht, ihren Mann zu beruhigen und aufzuheitern, aber Eisensteins Freund Dr. Falke schafft es, indem er ihm vorschlägt, heimlich zum Fest von Orlofsky zu gehen und die Strafe erst am kommenden Tage anzutreten. Dabei erinnert sich Eisenstein erfreut an einen anderen Ball, an dem er dem Dr. Falke, der damals als Fledermaus verkleidet war, einen Streich gespielt hatte. Verundert schaut Rosalinde ihrem Mann zu, wie er sich mit Frack und Zylinder auf dem Weg ins Gefängnis macht. Die beiden verabschieden sich mit gespielter Rührung. In der Zwischenzeit hat Adele nun doch frei bekommen, und Rosalinde empfängt nun Alfred, welcher sich auch gleich in den Schlafrock Eisensteins wirft und Rosalindes Sorgen mit Gesang und Trank erlischt. Jäh beendet wird die frohe Stimmung als plötzlich der Gefängnisdirektor Frank erscheint, um Eisenstein abzuholen. Um die Ehre Rosalindes zu retten, muss Alfred nun die Role Eisensteins übernehmen und mit Frank ins Gefängnis gehen.
 

Im Gartensalon des Prinzen Orlofsky. Dr. Falke verspricht dem jungen Prinzen viele heitere Momente an dem Abend, denn das Lustspiel, dass er vorbereitet habe, heisse Rache einer Fledermaus. Die Hauptfigur in diesem Spielist Eisenstein, welcher als Marquis Renard auftritt. Adele ist die zweite Hauptdarstellerin, welche in einer edlen Robe ihrer Herrin erscheint. Diese vermutet nicht, dass Dr. Falke sie zum Ball eingeladen hat und nicht ihre Schwester. Sie wird dem Prinzen als junge Künstlerin vorgestellt, und als Eisenstein seine berechtigte Vermutung äussert, sie sei ein Stubenmädchen, weiss sie dies geschickt zu leugnen. Die dritte Person in diesem Rachespiel ist Frank in der Rolle eines Chevalier Chagrin. Er freundet sich rach mit dem vermeintlichen Marquis Renard an. In der Zwischenzeit hat Dr. Falke Rosalinde verraten, wo sich ihr Gatte in Wirklichkeit aufhält. Schon erscheint sie auf dem Ball mit einer Maske und erregt die Aufmerksamkeit Eisensteins. Schlau wie sie ist, schafft sie es, Eisensteins Taschenuhr als ‚Corpus Delicti‘ an sich zu nehmen. Die Gesellschaft heisst Rosalindes Maskiertsein nicht gut, warum sie sich als ungarische Gräfin ausgibt, indem sie einen Csárdás zum Besten gibt. Danach fällt das allgemeine Gesprächsthema auf die Fledermaus. Aus diesem Anlass erzählt Eisenstein, wie er seinerzeit den als Fledermaus verkleideten Dr. Falke am Morgen des Aschermittwoch sturzbetrunken im Gehölz abgesetzt habe, worauf dieser – ausgelacht von den Gassenjungen – maskiert habe nach Hause gehen müssen und seither rundum als Dr. Fledermaus gehänselt worden sei. Über die Rache, mit der Dr. Falke ihm droht, lacht Eisenstein nur, ohne zu wissen, dass er bereits zum Opfer geworden ist. Fröhlich wird getrunken und gefeiert, bis die Glocke 6 Uhr schlägt und Frank und Eisenstein zum Aufbruch mahnt.
 

In der Kanzlei des Gefängnisdirektors. Stark angetrunken erscheint Frank in seinem Amt, wo ihn der Gerichtsdiener Frosch empfängt. Er möchte sich ausruhen, aber schon bekommt er Besuch: Als erste erscheint Adele, welche ihm verrät, wer sie wirklich ist und ihn bittet, sie für die Bühne ausbilden zu lassen, wobei sie ihm gleich ein paar Kostproben ihres schauspielerischen Talentes gibt. Dann kommt Eisenstein, welcher staunend feststellt, dass hier Chevalier Chagrin als Gefängnisdirektor sitzt. Er möchte jetzt aber doch beweisen, dass er Eisenstein ist, muss aber gleich erfahren, dass Frank selbst den Eisenstein gestern Abend hierhergebracht hat. Er hat einen furchtbaren Verdacht. Um Gewissheit zu erlangen, legt er sich die Robe des Advokaten Blind um, der mittlerweile herbeigerufen worden ist und fängt an, seine vor Ort erschienene Frau und Alfred zu verhören. Er ist so wütig, dass er sich bald verrät, aber kleinlaut wird, ale Rosalinde ihm die Uhr zeigt, welche sie im beim Ball von Orlofsky abgenommen hat. Also kann er ihr keinen Vorwurf machen. Aber er hätte es noch immer gern, wenn Alfred an seiner Stelle die Strafe absitzen würde, was natürlich nicht geht. Als sich nun die ganze Gesellschaft vom Vorabend und auch Orlofsky mit Dr. Falke einfinden, begreift er endlich, das er selber der Rache der Fledermaus zum Opfer fiel. Prinz Orlofsky, der sich über dies alles grossartig amüsiert hat, verspricht Adele, ihr Kunstmäze zu sein.